En godmikroskopskal have tre egenskaber:
God opløsning: Opløsningsevne refererer til evnen til at producere separate billeder af tæt placerede objekter, så de kan skelnes som to separate enheder. Løsning:
Cirka 0,2 mm (200 μm) for det blotte øje
Optisk mikroskop er omkring 0.2μm
Elektronmikroskopi er omkring 0,5 nm
. Opløsningen afhænger af brydningsindekset. Olie har et højere brydningsindeks end luft.
God kontrast: kan forbedres yderligere ved at farve prøven.
God forstørrelse: Dette opnås ved at bruge konkave linser.
Lysfelt eller lysmikroskopi
Brightfield eller lysmikroskopi producerer mørke billeder mod en lysere baggrund.
mørkefeltsmikroskopi
Princip: I mørkefeltsmikroskopi fremstår objekter lyse mod en mørk baggrund. Dette kan opnås ved at bruge specielle darkfield-kondensatorer.
Anvendelser: Anvendes til at identificere levedygtige, ufarvede celler og tynde bakterier såsom Spirochaetes, der ikke kan observeres ved lysmikroskopi.
fasekontrastmikroskop
Den visualiserer levende celler ved at skabe kontrastforskelle mellem celler og vand. Det konverterer subtile forskelle i brydningsindeks og celletæthed til let påviselige ændringer i lysintensitet.
Nyttigt til at studere:
mikrobiel bevægelse
Bestem formen på levende celler
Detekter bakterielle komponenter såsom endosporer og inklusionslegemer.
Fluorescensmikroskop
Sådan virker det: Når fluorescerende farvestoffer udsættes for ultraviolet (UV) lys, exciteres de og fluorescerer, dvs. de omdanner denne usynlige, kortbølgede stråle til lys med længere bølgelængde (synligt lys).
Anvendelser: Epifluorescensmikroskopi har følgende anvendelser:
Autofluorescerer, når det placeres under UV-lys, såsom cyclosporin
Mikroorganismer belagt med fluorescerende farvestoffer, såsom atriol orange til malariaparasitter (QBC) og aurinol til Mycobacterium tuberculosis.
Immunfluorescens: Det bruger antistoffer mærket med fluorescerende farvestoffer til at detektere celleoverfladeantigener eller antistoffer, der binder til celleoverfladeantigener. Der er tre typer: direkte IF, indirekte IF og flowcytometri.
elektronmikroskop
Den blev opfundet af Ernst Ruska i 1931. Den adskiller sig fra lysmikroskopi på en anden måde.
Der er to typer EM:
Transmission EM (MC-type, undersøger intern struktur, opløsning 0.5 nm, giver en todimensionel visning)
Scanning EM (undersøger overfladen med en opløsning på 7 nm, hvilket giver en 3D-visning)
Principper for transmissionselektronmikroskopi
Prøveforberedelse: Udfør følgende trin på celler for at forberede meget tynde prøver (20 til 100 nm tykke)
Fiksering: Fikser celler ved hjælp af glutaraldehyd eller tetroxid for at stabilisere dem.
Dehydrering: Prøven dehydreres derefter med et organisk opløsningsmiddel såsom acetone eller ethanol.
Indstøbning: Prøven er indlejret i en plastisk polymer, som derefter hærder til en fast masse. De fleste plastpolymerer er vanduopløselige. Derfor skal prøver være fuldstændig dehydreret før indlejring.
Sektionering: Prøven skæres derefter i tynde sektioner med en ultramikrotom, og sektionerne monteres på metalobjektglas (kobber).
Fryseætsningsteknik: Dette er en alternativ metode til at visualisere organeller inde i celler til præparation af prøven.
Cellerne fryses hurtigt, derefter opvarmes → sprænges ved hjælp af en kniv for at blotlægge de indre organeller → sublimeres → dækket med platin- og kulstofbelægninger.
Foranstaltninger til forbedring af EM-kontrast omfatter:
Farvning med opløsninger af tungmetalsalte såsom blycitrat og uranylacetat
Negativ farvning med tungmetaller såsom phosphowolframsyre eller uranylacetat.
Skygge: Prøven er belagt med en tynd film af platin eller andet tungmetal i en 45 graders vinkel, så metallet kun rammer mikroorganismerne på den ene side.
