Fluorescens er en fysisk effekt forårsaget af udsendelse af lysenergi, når et stof belyses af lys eller andre former for elektromagnetisk stråling. Fluorescensmikroskopi er et optisk mikroskop, der bruger fluorescens og phosphorescens in situ eller i kombination med refleksion og absorption til at studere de optiske egenskaber af organiske og uorganiske objekter. Fluorescensmikroskopi hjælper med at se de subcellulære og indre strukturer af objekter tydeligere. Det blev opdaget i begyndelsen af det 20. århundrede af August Köhler, Carl Reichert og Heinrich Lehmann.
Artikelindeks (klik for at springe)
Hvordanfluorescensmikroskopiarbejder
Fluorescensmikroskopi arbejder
Fluorescensmikroskopkomponenter
1. Fluorofor
2. Lyskilde
3. Excitationsfilter
4.Dichroic spejl
5. Udledningsfilter
Fordele ved fluorescensmikroskopi
Ulemper ved fluorescensmikroskopi
Anvendelser af fluorescensmikroskopi
Sådan fungerer fluorescensmikroskopi
Fluorescensmikroskopi fungerer normalt ved at farve sammensætningen og strukturen af en prøve med farvestoffer. Dette skyldes, at de fleste cellulære komponenter er farveløse i naturen. Derfor kan de ikke let skelnes fra hinanden. Fluoroforer eller fluorescerende molekyler belyst med lys med kort bølgelængde eller elektromagnetiske stråler har en tendens til at udsende lys. Det udsendte lys har en længere bølgelængde sammenlignet med det indfaldende lys. Typisk måles varigheden mellem bestråling og emission i nanosekunder og kan let ignoreres. Det udsendte lys er adskilt fra det indfaldende lys, som fortæller den nøjagtige placering af fluoroforen. Billedet af prøven genereres baseret på sekundært lys i stedet for primært indfaldende lys.
Fluorescensmikroskopi arbejder
Fluorescensmikroskopi fungerer på samme måde som lysmikroskopi. Den består af en stærk lyskilde, et specielt båndpasfilter og en fluorescerende etiket af prøven. Prøven, der skal undersøges, placeres under et mikroskop. Lys med en bølgelængde kort nok til at excitere fluoroforen belyses på prøven. Ved hjælp af en objektivlinse fokuseres dette lys på prøven. De excitationsstråler, der udsendes af prøven, fokuseres derefter på detektoren gennem objektivlinsen. Hoveddelen af excitationslyset transmitteres gennem prøveobjektet, mens en del af det reflekteres tilbage og når detektoren.
Fluorescensmikroskopkomponenter
1. Fluorofor
En fluorofor er en forbindelse, der udsender lys, når den exciteres af elektromagnetiske eller lysbølger. Det kaldes også et fluorescerende farvestof. Fluoroforer består grundlæggende af en kombination af aromatiske grupper eller plane/cykliske molekyler med forskellige π-bindinger.
2. Lyskilde
Lyskilden er en af de vigtigste komponenter i et fluorescensmikroskop. Her er de mest almindelige lyskilder, der bruges til excitation, lasere, højeffekt LED'er, xenonbuelamper, kviksølvdamplamper osv.
3. Excitationsfilter
Excitationsfiltre, der bruges i fluorescensmikroskopi, er typisk båndpasfiltre, som tillader signaler, der falder inden for en bestemt båndbredde, mens de afviser alle andre signaler. Bølgelængderne absorberet af fluoroforen passerer let, mens den reflekterede optiske stråling blokeres.
4.Dichroic spejl
Dichroic spejle fungerer som tyndfilmfiltre. Det primære formål med et dikroisk spejl er at selektivt passere lys af et lille udvalg af farver, mens det reflekterer alle andre farver. Det er også kendt som præcist farvefilter.
5. Udledningsfilter
Emissionsfilteret er et båndpasfilter. Emissionsfiltre fungerer på samme måde som excitationsfiltre. Det udstråler lys, der udsendes af fluoroforen, mens det blokerer for excitationslyset.
Fordele ved fluorescensmikroskopi
1. Følsomheden af fluorescensmikroskopi er meget høj, svarende til ca. 50 molekyler pr. kubikmikrometer.
2. Med fluorescensmikroskopi kan forskellige molekyler farves i forskellige farver, hvilket giver brugerne mulighed for at afbilde flere molekyler af et stof på samme tid.
3. Fluorescensmikroskoper er mere effektive end traditionelle optiske mikroskoper.
4. Kan bruges til in vivo og in vitro billeddannelse.
5. Fluorescensmikroskopi kan adskille individuelle proteiner med høj præcision.
6. Fluorescensmikroskopi er bedst egnet til billeddannelse og undersøgelse af den dynamiske adfærd udvist af levende celler.
7. Fluorescensmikroskopi er i stand til at producere højopløselige og klare billeder og derved forbedre forskningen.
8. Det kombinerer forstørrelsesegenskaberne ved optisk mikroskopi med visualisering af fluorescens.
9. Fluorescensmikroskopi kan bruges til at generere 3D forstørrede billeder af prøven, der undersøges.
Ulemper ved fluorescensmikroskopi
1. Fluorescerende forbindelser eller fluoroforer til stede i fluorescensmikroskopi har en tendens til at miste deres evne til at udsende lys over tid, når de exciteres på grund af en proces kaldet fotoblegning. Fotoblegning opstår typisk, når et fluorofor-molekyle er kemisk beskadiget på grund af elektronisk excitation under fluorescens.
2. Det tillader kun observation og undersøgelse af visse strukturer i prøven, der er blevet fremhævet og mærket som fluorescerende.
3. Når fluorescerende materialer bestråles af lys, producerer fluorescerende molekyler ofte kemikalier, hvilket yderligere fører til fototoksicitet. Denne fototoksiske effekt ødelægger de oprindelige egenskaber af den observerede prøve. Fototoksiciteten af kortbølget lysstråling er relativt høj.
4. Fluorescensmikroskopi kan ikke give information om lipid-dobbeltlaget, især for SUV'er.
5. Fluorescensmikroskopi kan ikke give nogen afgørende observationer relateret til dobbeltlagskarakteren eller lamellariteten af vesiklerne.
6. Tilsætning af prober og farvestoffer interfererer ofte med egenskaberne af lipidvesikler, hvilket fører til unøjagtig datafortolkning og derved ødelægger eksperimentets autenticitet.
7. Lysinduceret lipidperoxidation kan føre til domænedannelse.
Anvendelser af fluorescensmikroskopi
1. Fluorescensmikroskopi bruges i vid udstrækning til at studere den indre struktur af prøver på mikroskopisk niveau med den højeste kvalitet.
2. Fluorescensmikroskopi er bedst egnet til at studere levende biologiske prøver.
3. Denne type mikroskop foretrækkes ofte ved mærkning af de inderste strukturer af celler eller mikroorganismer.
4. Hjælper med at måle den fysiologiske tilstand af celler eller prøver, der observeres.
